Apoptose-Nachweiskit-TUNEL-Nachweismethode

Tatsächlich gibt es im streng lexikalischen Sinne einen großen Unterschied zwischen programmiertem Zelltod (PCD) und Apoptose. Der programmierte Zelltod ist ein Funktionskonzept, das bestimmte Zelltods in einem mehrzelligen Organismus als einen vorbestimmten und streng kontrollierten normalen Teil der Ontogenese beschreibt. Apoptose ist ein morphologisches Konzept, das eine Form des Zelltods beschreibt, die sich von der Nekrose mit einem vollständigen Satz morphologischer Merkmale völlig unterscheidet. Morphologische Veränderungen der Zellapoptose: Zellmembranen und Organellen sind relativ vollständig. Die Kernpyknose von links nach rechts ist Kernschrumpfung, Kernlyse und Kernfragmentierung. Als nächstes lernen wir die Nachweis-Messmethode-Methode der Apoptose kennen: Gemäß der Klassifizierung umfassen die Nachweismethoden der Apoptose den morphologischen Nachweis, den Nachweis der Zellfunktion und den Nachweis biochemischer Marker. Was sind die Vor- und Nachteile dieser Methoden? 1. Morphologische Nachweismethoden: 1) Beobachtung der submikroskopischen Struktur von Organellen, Elektronenmikroskop: Vorteile: Der Goldstandard für den Nachweis von Apoptose. Nachteile: nicht quantifizierbar; umständliche experimentelle Verfahren 2) Kernfärbung und mikroskopische Untersuchung (Hoechst 33342) Vorteile: niedrige Kosten, bequemer Betrieb und quantifizierbar. Nachteil: Die Zellen müssen gezählt werden. 2. Methode zur Erkennung der Zellfunktion: 1) Erkennung des Mitochondrienmembranpotentials JC-1, MitoTracker Vorteile: Geeignet für die bildgebende Erkennung, Färbeergebnisse können nur zur Bestimmung der Linie verwendet werden. Nachteile: Ob das Mitochondrienmembranpotential verloren geht, kann nicht quantifiziert werden. 2) Nachweis von Phosphatidylserin auf der Zellmembranoberfläche. Vorteile von Annexin V-AbFluor 488 / PI: eine beliebte Methode zum Nachweis von Apoptose. Nachteile: Es ist notwendig, eine Einzelzellsuspension herzustellen, um den Anteil der Apoptose in verschiedenen Zeiträumen zu quantifizieren. 3. Biochemischer Marker-Nachweis 1) Apoptose-molekularer Marker-Nachweis Caspase-Aktivitäts-Nachweis Vorteile des Caspase-Inhalts-Nachweises (WB): Hochdurchsatz-Screening und quantitativ. 2) Erkennung von DNA-Schäden. Vorteile der DNA-Elektrophorese TUNEL-Methode: Sie eignet sich zur Apoptosestudie von Gewebeschnittproben. Nachteile: Der Nachweis der Elektrophorese ist zeitaufwändig, nicht quantifizierbar und von geringer Stabilität. Kombinationsnachweismethode zur genauen Apoptoseerkennung 1. Die Annexin V-AbFluor 488 / PI-Nachweismethode verwendet Annexin V-AbFluor 488 (grüne Fluoreszenz) und PI (rote Fluoreszenz) zusammen, wodurch frühe Apoptose und Apoptose von späten und toten Zellen genau unterschieden werden können. Bei dieser Methode bestimmen Probenverarbeitung, Färbevorgänge und Fluoreszenzfotografie die Genauigkeit der Apoptoseerkennung. Für nicht verwendete Proben und unterschiedliche Nachweismethoden wird empfohlen, die folgenden wertvollen Erfahrungen zu machen: 1. Der Schlüssel zur Fluoreszenzfotografie 1) Suspension oder Resuspension Machen Sie Fotos von Objektträgern. Resuspendieren Sie die Zellen mit einer kleinen Menge PBS oder Resuspensionslösung, um ein Zellkonzentrat zu bilden. Pipettieren Sie 5-10ul auf einen sauberen Objektträger, um einen Kreis zu verschmieren. Decken Sie das Deckglas ab und sofort unter dem Mikroskop. Führen Sie eine mikroskopische Untersuchung durch. Achten Sie während der Verarbeitung auf die Geschwindigkeit, damit die Zellen nicht absterben. Die Resuspensionsdichte ist nicht zu klein. Beim Verschmieren sollte das Zellsuspensionsvolumen weniger als 10 ul betragen. Es wird empfohlen, den gesamten Vorgang innerhalb von 10 Minuten abzuschließen. 2) Am Boden der kleinen Zellkulturschale oder der Fotokletterschale befindet sich eine kleine Menge Puffer, um trockene Scheiben zu vermeiden. Achten Sie darauf, vor dem Aufnehmen von Bildern vorsichtig zu reinigen, um zu verhindern, dass eine unzureichende Reinigung während des Fotoprozesses einen unspezifischen Hintergrund verursacht. Hela-Zellen wurden 24 Stunden mit Camptothecin induziert und mit Annexin V-AbFluor 488 Apoptosis Detection Kit (KTA0002) angefärbt. Kann mit Annexin V-AbFluor 488 / PI (grüne Membran und roter Fragmentkern) gefärbt werden, sind frühe apoptotische Zellen, Nekrose oder späte apoptotische Zellen. 2. Wichtige Schritte der Durchflusszytometrie 1) Vermeiden Sie falsch positive Ergebnisse bei der Verdauung von Zellen. Um falsch positive Ergebnisse zu vermeiden, wird Trypsin ohne EDTA zur Verdauung von Zellen empfohlen. 2) Stellen Sie die Kontrollgruppe ein. Die in der Durchflusszytometrie gemessene Menge ist ein relativer Wert, kein Wert. Wenn Sie den Wert wissen möchten, müssen Sie eine Kontrollgruppe einrichten, die eine negative Kontrolle und eine positive Kontrolle umfasst. Es wird empfohlen, beim Testen an der Maschine eine Blindgruppe und eine Kontrollgruppe für Annexin V-AbFluor 488 / PI-Einzelfärbungsgruppen festzulegen. Das Durchflusszytometer muss im Voraus angepasst werden. 3) Die Menge der zu testenden Zellen sollte moderat sein. Es wird empfohlen, eine ausreichende Menge an Zellen vorzubereiten. Im Allgemeinen wird empfohlen, 1 × 10 6 Zellen herzustellen. Wenn zu wenige Zellen vorhanden sind, erhöht sich der Probenfluss und der Variationskoeffizient wird beeinflusst. Das Ergebnis ist nicht genau. Relativ unzureichende Antikörper oder d